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文|娱栀

编辑|娱栀

前言

多年来，科学界一直在贫瘠的水箱中饲养和饲养斑马鱼，以减少实验变异，并促进健康监测和饲养实践。

因为在野外，这些鱼会遇到丰富的环境和各种刺激，这些刺激直接影响它们的行为和生理反应。

所以暴露于实验室条件限制了圈养动物表达完整的行为库，并可能诱发压力，尽管如此，斑马鱼作为神经科学实验室模型的使用继续增加，科学界已经努力改善圈养条件。

主要是想通过根据实验动物的自然历史，改变其居住环境并允许表达物种特异性行为，来提高实验动物的福利。

斑马鱼的栖息地

可是自然界斑马鱼栖息地的多样性使得很难选择最佳的富集组合来测试，迄今为止，有证据表明斑马鱼更喜欢环境富集，而不是贫瘠的环境，如砾石、砾石图像或植物。

此外当使用不可预测的慢性应激时，富集减弱了其对行为和生理参数的影响，降低了动物对应激的脆弱性。

总的来说管道和植物已被用于鱼类物种中，以提供庇护所，以抵御侵略性同种动物和水箱干扰，尽管如此在斑马鱼养殖中单独使用植物或与其他富集形式结合使用时时的相反效果。

毒理学和生物学问题，阻碍了其应用，砾石使用或其他需要不断清洁以避免产生生物膜的基材也会发生同样的情况。

或者砾石图像可用于商业用途，并且不会干扰饲养程序或水质，但它们对斑马鱼福利的有益影响尚不清楚，例如砾石图像和漂浮植物富集4个月不会对斑马鱼应激恢复产生影响。

因此需要澄清斑马鱼的最佳富集以及应该在多大程度上使用它，因为文献表明并非所有“富集”方案都能提供积极的好处。

在这里这项研究的主要目的是评估不同住房条件对斑马鱼体长，生理和行为的影响，砾石图像和管道等两种丰富物的结合对斑马鱼福利的改善很有吸引力，因为它可以通过提供隐藏空间或庇护所，来增加动物的安全感。

以及针对危险情况的伪装背景，有利于自然行为的表达，因此假设在环境丰富的条件下，痛苦、焦虑样行为和异常行为会减弱。

由于行为和生理分析通常用于研究痛苦，这项工作的次要目的是测试皮肤粘液收集，作为测量斑马鱼皮质醇的新方法，皮质醇通常从斑马鱼的全身匀浆中提取，这意味着动物的死亡，并阻碍了重复测量的可能性，我们的目标还在于开发一种简单的方法来测量皮质醇。

该方法可以在几个实验室中轻松实施，使用简单的皮质醇提取和ELISA方法，而斑马鱼的皮肤粘液是一种有前途的研究基质。

因为它的组成已被描述为以与血浆相当的方式改变鱼类的健康，此外它的收集可以是非终端的，它是微创的，实用的，并且执行迅速。

此外斑马鱼还允许对鱼类进行纵向测量，最后两种皮质醇基质的结果应该相似，支持皮肤粘液作为一种侵入性较小的基质。

动物和住房

野生型AB斑马鱼是在内部养殖的，胚胎用0.5%的氯胺-T0.0037%溶液消毒，然后分组安置在容量为24L的玻璃罐中，所有水箱都是开放系统的一部分，该系统提供紫外线消毒的自来水。

保持在受控温度和光周期，坦克被放置在白色聚苯乙烯泡沫塑料的顶部，并由天花板安装的发光二极管照亮，斑马鱼每天用斑马饲料手工喂养幼鱼、幼鱼和成鱼。

根据制造商的说明，在安乐死前24小时应用饲料剥夺，以消除喂养对皮质醇水平的影响，必要时在不改变结构和设备位置的情况下进行储罐维护。

实验设计

胚胎消毒后，将150个胚胎放入每个研究水箱，在那里它们孵化并在相同的住房条件下保持长达6个月，因此坦克是实验单元，使用两个方法学重复。

即两批动物，每批随机分配到住房条件中;第一个重复包括每个条件的两个罐，第二个重复每个条件三个罐。

这在统计模型中被考虑在内，浓缩罐包括放置在储罐外部底部的砾石图像和3个深灰色的PVC管段，在这两种情况下，储罐都配备了加热器和温度计。

行为测试在动物被安置的同一个房间进行，在动物被采样进行生化分析的前一天，记录是用数字摄像机进行的。

从上午10：00开始，到下午16：00结束，顺序如下：浅滩，白色/黑色水箱和新型水箱测试，每次测试涉及不同的动物，每个行为装置的水在动物/试验之间完全被新鲜系统水取代。

为了防止对同一条鱼进行两次采样，鱼在测试后被转移到另一个水箱，这些动物也在测试之间随机分布，一位研究人员在分析行为数据时对住房条件和批次视而不见。

在行为测试之前，还对三个浓缩水箱进行了为期三天的家庭储罐记录，以观察前管的入口和出口数量，并得出结论动物是否使用这些结构或与这些结构相互作用。

由于斑马鱼浅滩在压力或威胁事件中会收紧，因此使用浅滩测试来评估群体凝聚力，为此将每个水箱五条鱼放入一个24×24厘米的玻璃缸中，水柱为4厘米，在适应周围环境30分钟后。

从上方对动物的浅滩行为进行了10分钟的录像，使用该软件置信阈值为40，平均过滤器大小为3像素，以量化平均鱼间距离，以及邻居最近和最远距离。

白色/黑色水箱测试是一种焦虑测试，基于斑马鱼对深色背景的自然偏好，而不是白色和明亮的环境，测试在一个水箱中进行，该水箱均匀地分为黑白面，并充满4厘米的水柱。

总共分析了每种住房条件的25条鱼，将每条鱼放在水箱的白色一侧，并记录其行为7分钟，测量时间，行进距离，平均速度，不动和白色一侧的条目数量。

还确定了在黑色侧进入和在白色侧重新进入的延迟，行为终点是使用Any-mazeTM行为跟踪软件获得的，新的水箱测试认为新环境对斑马鱼具有抗焦虑作用。

诱导水箱底部的更高占用，然后随着水箱顶部探索的增加逐渐适应环境，因此在这项研究中，将动物单独转移到一个新的水箱中。

放置在白色长凳上，墙壁和背部覆盖着沉闷的白纸以方便跟踪，并且水箱中装满了12厘米的水柱。

使用顶部摄像头记录了6分钟的空间占用和探索行为视频，两个研究组的测试罐中都没有内部或外部富集。

坦克实际上分为上和下区域，行进距离、平均速度、角速度、时间、不动和不稳定运动使用Any-mazeTM软件进行分析。

在观察新颖的水箱视频时，注意到一种重复的行为，斑马鱼使用盘旋行为多次用嘴触摸水箱壁。

为了确保这不会干扰对新储罐中测试的其他变量的观察，使用BORISv.7.13.5行为观察研究交互式软件。

意大利都灵软件，每次接触在鱼第四次用嘴接触缸壁后开始，在鱼向相反方向游动之前以最后一次接触壁结束。

行为测试后的第二天，每个水箱有三条鱼用MS222安乐死，然后将两条鱼放在浸有安乐死溶液的海绵上，并使用无菌拭子擦拭每条鱼的左胁六次。

从胸鳍到尾鳍的起点，在每次拭子中间进行拭子旋转，以尝试最大化粘液收集，然后将两支拭子的棉尖作为一个样品，汇集在具有500μL冰冷PBS的Eppendorf管中，以获得有意义的皮质醇值用于测定分析。

接下来取出第三条鱼的头部，并将树干收集在5mL冰冷的PBS中，雄性立即取样，而雌性则在采集之前提取卵，并用冰冷的PBS清洗树干，以分离任何卵并避免皮质醇基质之间的交叉污染。

重复收集三条鱼的样品，直到获得每个水箱中每个基质四个样品，每条鱼都被分配到一个特定的矩阵，解剖材料用70%的酒精消毒，并在每只动物之间用冰冷的PBS清洁。

TheDigimizer用于分析在采样期间获得的每个水箱八条鱼的照片，以评估住房如何影响生长，体长测量为鼻子到尾柄之间的距离。

从每个水箱中随机选择用于测量皮质醇的鱼的六个大脑进行氧化应激分析，在不到1分钟的时间内收集每个样品并储存在-20度直至处理，这些动物之前没有在所描述的行为测试中进行测试。

每个水箱中一个由六个斑马鱼脑组成的池在冰冷的缓冲液中均质化，通过在组织分析器II中通过珠子跳动。

均质化后，将样品在冷却的离心机及其上清液用于测量氧化应激生物标志物，因此使用二氯荧光素二乙酸酯作为探针染料。

根据在530和32nm处测量活性氧超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别通过33nm处的硝基蓝四唑还原和7nm处的过氧化氢测定。

使用34-氯-240，35-二硝基苯与1nm处的还原型谷胱甘肽偶联，来测定谷胱甘肽-s-转移酶活性，谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，是通过NADPH在2nm处的氧化和还原来测量的。

GSH和氧化谷胱甘肽状态在340nm和340nm处定量，氧化应激指数由GSH：GSSG比率给出。

硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）活性反映了脂质过氧化的程度，并在320加合物和420nm处测量，蛋白质氧化指示剂羰基通过Mesquita等人的DNPH方法在2nm处测定。

基于Ellman方法，在微孔板上分析了39nm处的乙酰胆碱酯酶活性，用于评估乳酸脱氢酶在340nm处的活性所有样品一式两份运行。

并使用PowerWaveXS30微孔板扫描分光光度计或瓦里安CaryEclipse分光荧光计在2度下针，对试剂空白进行测量，在BioTekTake280微量板中以3nm处测定每个样品中的蛋白质含量。

结语

用眼科剪刀在500μLPBS中切割斑马鱼树干，然后在室温下通过FastPrep-3进行均质化，皮肤粘液样品在溶剂萃取前仅涡旋，之后，500或750μL甲醇分别添加到粘液或树干的每个样品中。

然后将样品在室温下在实验室滚筒中过夜60小时，该滚筒根据Dhankani和Pearce在内部制造，第二天，将样品×在冷却的离心机，上清液转移到新的微量离心管中。

最后置于真空浓缩器上，温度为4度，在蒸发前从粘液样品管中取出拭子，溶剂蒸发后，分别向每个树干或粘液样品中加入5415或131μL测定稀释剂，然后将样品在36度的冰箱中孵育过夜，第二天，500μL正己烷被添加到树干样品中。

以消除沉淀脂质的干扰，然后将这些样品在-4度下冷冻500分钟，然后去除有机层，在此步骤之后，根据ELISA试剂盒的说明分析所有样品。

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