团头鲂和斑马鱼在不同饥饿程度下的免疫功能变化是什么？

文| 青橘罐头

编辑 | 青橘罐头

团头鲂俗称武昌鱼，是我国特有的经济鱼类，现于全国范围内广泛养殖，在我国现阶段的水产养殖中，为了提高产量，养殖多为大规模、高密度化养殖。

如此一来，就可能导致鱼类因为饲养密度过大、天气变化、投饲技术投饲策略不合理等因素而遭受饥饿胁迫。

饥饿胁迫可以对动物体的生长发育、组织结构、酶活性以及免疫功能等产生影响，严重时可诱发多种疾病，甚至导致机体死亡。

但是，也有研究表明饮食限制有利于哺乳动物应对自身免疫疾病。

那么，饥饿到底对鱼类免疫功能有什么样的影响？饲料剥夺是否能够成为治病的辅助策略？

了解鱼类的免疫系统和免疫原理，清晰理解鱼类免疫的相关知识，是我们进行相关研究的前提和基础。

免疫系统是生物体维持内环境稳态，实现自我保护的重要屏障，它具有识别和消灭“非自身物质”的功能。

与哺乳动物一样，鱼类的免疫系统也可分为两种，即先天性免疫和获得性免疫。

不同的是，鱼类属较低等变温脊椎动物的鱼类与哺乳动物相比，其特异性免疫应答能力水平较低，通常是非特异性免疫在鱼类防御外来病原入侵中起主要作用。

其中，团头鲂感染嗜水气单胞菌之后起作用的主要是先天性免疫系统。

鱼类的主要免疫器官和组织包括:肾(尤其是头肾)、脾脏、胸腺和粘膜相关的淋巴组织，

鱼类肾脏是其重要的免疫器官，可以分为头肾和体肾，头肾是B淋巴细胞和红细胞的重要产生场所，作为鱼类第二个开始发育的免疫器官，在其免疫应答过程中发挥着极其重要的作用。

脾脏则是免疫系统中最后发生的免疫器官，但它与造血储血密切相关，草鱼免疫应答的T细胞则主要在胸腺中产生。

如果团头鲂受长期饥饿时，肝脏细胞会产生明显的炎症反应，肝脏中也可以观察到炎性细胞浸润现象。

除此之外，作为抗氧化酶系统中的关键酶，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶(CAT)的活性，也可以用来评判机体抗氧化能力。

在生物体中SOD和CAT主要参与自由基清除，保持内环境中的自由基水平适宜，可以防止自由基水平过高对危害机体健康。

SOD酶活性降低，预示着机体内自由基过多，自由基水平过高会对一些重要的生化过程产生影响，导致体内免疫水平下降，机体患病风险增加。

在了解了这些相关理论后，我们便可以展开饥饿胁迫对团头鲂和斑马鱼免疫功能影响的实验。

我们所选用的斑马鱼均为AB品系，且每日上午9时和下午4时分别饲喂丰年虫。

我们按照30尾/缸养殖在循环水养殖缸(3L)中，水温设置为261℃，pH7.0-8.0，光暗周期=14/10h。

待斑马鱼性成熟后(3月龄)，将其分为7个组，分别饥饿0、1、3、7、14、21和28d。

饥饿处理完成后，每个组分别选取60尾，生长状况良好大小相近的斑马鱼进行下一步实验。

其中30尾注射嗜水气单胞菌，另外30尾则注射等量PBS溶液。

另一方面，团头鲂在饲养期间每天投喂2次颗粒饲料，待团头鲂适应新的养殖环境后，选取生长状况良好大小相近的个体称重，并将其分为7个组，分别饥饿0、1、4、7、14、21和28d。

饥饿处理完成后，每个组分别选取30尾团头鱿进行下一步实验。

斑马鱼感染预实验设5个菌液浓度:5x105CFU/mL、1x10°CFU/mL、2x106CFU/mL、5x106CFU/mL、1x107CFU/mL，以用于筛选合适的浓度。

结果表明，每尾斑马鱼注射0.1uL2x10CFU/mL嗜水气单胞菌时接近半致死浓度。

在注射嗜水气单胞菌或PBS溶液12h后，随机选择9尾马鱼，经MS-222麻醉处理后取肝脏、鳃和肠3个组织，分别保存于液氮用于总RNA抽提取。

肝脏和肠组织保存于4%的多聚甲醛溶液中，用于组织切片分析，同时取饥饿0、4、7、14、21和28d等6组的团头肠道微生物，并分别命名为A0、BO、CO、D0、EO和FO组，用于肠道微生物测序分析。

经过分析我们发现，饥饿胁迫的确可以对斑马鱼和团头鲂的免疫功能产生一定的影响，但却并非线性相关。

我们分别取未饥饿(饥饿0d)和饥饿3、7和21d的鱼的肠组织制作石蜡组织切片，进行HE染色，然后拍照观察其肠道形态和微绒毛结构变化。

结果发现，随着饥饿时间的增加，肠内褶皱减少，固有层逐渐扩展。

在较高倍数下观察微绒毛结构发现，随着饥饿时间的增加，绒毛高度降低，柱状细胞排列紧密性下降，但杯状细胞的数量增加。

这说明受饥饿胁迫的影响，斑马鱼的肠道形态发生了改变，同时，微绒毛结构发生改变，尤其是杯状细胞数量增加，以适应饥饿胁迫带来的变化。

而且与对照组相比，经过短期饥饿(3d)的马鱼肠组织的AKP和ACP活力均显著下降，SOD与CAT活力显著升高。

在经历长期饥饿胁迫时，AKP活力恢复到正常水平，但ACP在饥饿7d和14d时活力显著增加，CAT活力则在饥饿14d时显著下降。

且经历饥饿胁迫的斑马鱼感染嗜水气单胞菌后，其肠组织中免疫相关酶的活性变化趋势并未出现明显的变化。

但是，与饥饿相同时间但未感染嗜水气单胞菌的斑马鱼相比较，这4种的表现却不尽相同。

也就是未饥饿组的AKP与ACP活力比未感染的低，在经历短期饥饿之后，其活力比未感染组的要高，但在饥饿7d和饥饿14d的时候，又变为比未感染组的低。

而SOD和CAT的表现明显不一样，总体而言，与饥饿相同时间但未感染的组相比，它们的活力都会略高一些，且在饥饿1d的时候，两组之间的SOD活性出现了显著性差异。

由此可见，饥饿胁迫影响斑马鱼肠组织中AKP等免疫相关酶的活性，且能够影响斑马鱼在感染嗜水气单胞菌后肠组织内免疫相关酶的表达。

通过数据分析可以发现，与对照组相比，饥饿1、3、14、21d都会导致马鱼肠道中TLR2和TLR4a基因的表达量显著下调。

仅在饥饿7d时其表达量显著上调，并达到峰值。

MvD88基因的表达量则呈现出“降-升-降”的趋势，但在受到饥饿胁迫之后，其表达量均显著低于对照组。

NFkB基因也呈现“降-升-降”的趋势，但不同的是，饥饿3d和7d时其表达量显著高于对照组，且在饥饿7d时达到峰值。

而IL-IB和IL-6基因的表达量变化差异较大，总体上呈“升-降-升-降”且在饥饿1、7、14d时显著高于对照组。

同时，在饥饿3d时又都显著低于对照组，两个基因间唯一不同的是表达量峰值出现的时间不一样。

IL-IB出现在饥饿1d，而IL-6在饥饿7d，短期饥饿胁迫则引起TNF-a表达量显著下调，其表达量在饥饿7d后达到了显著高于对照组的峰值。

与仅遭受饥饿胁迫的斑马鱼相比较，饥饿后再感染嗜水气单胞菌的斑马鱼肠组织中这些基因的表达模式明显不同。

首先，TLR2基因表达量的变化趋势虽然也是“降-升-降”，但是其峰值不再是对照组，而是出现在饥饿3d时，且饥饿7d时的表达量业余对照组相当。

而TLR4a基因表达量变化趋势则从“降-升降”变为了“先升后降”，且在饥饿1d和3d时的表达量显著高于其他时间点。

MD88基因在饥饿3d时的表达量显著上调，而其他时间点之间的表达量并无显著性差异。

NFKB基因的表达量变化趋势并没有太大变化，但是其峰值出现的时间点变为了饥饿3d，且仅有该峰值显著高于对照组的表达量。

团头鲂的体重在饥饿胁迫下产生了显著的变化，具体表现为，随着饥饿时间的增加，团头体重总体上呈显著下降趋势。

当饥饿时间小于7d时，只有饥饿d(对照组)的体重显著高于另外几个时间点，而另外几个组之间体重并未出现显著性差别。

这可能是饥饿0d的团头鲂肠道内还有大量未消化的饲料，在遭遇饥饿胁迫时，没有摄取新的食物，而肠道内原来的饲料经消化吸收后排除体外，从而引起了这一变化。

同时，这种变化也说明，短时间的饥饿胁迫并不会引起团头体重出现显著性的下降(饥饿7d相较于饥饿1d，体重仅下降了4.73%)。

当饥饿时间超过7d之后，团头鲂的体重显著下降(较饥饿1d相比，下降率分别为11.98%、15.38%、18.25%)，但饥饿21d和饥饿28d两组之间的体重未出现显著性差别。

这说明，长时间的饥饿胁迫依然会导致团头鱿的体重下降但随着饥饿时间的延长，其下降趋势可能会逐渐变缓。

由此可见，饥饿胁迫会引起团头体重下降，但这种下降会呈现出“慢-快-慢”的趋势，饥饿初期并不会引起其体重迅速下降，在饥饿达到一定时间(721d)后，其体重显著下降，而随着饥饿时间增加，其体重下降的趋势逐渐变缓。

取未饥饿(饥饿0d)和饥饿4、7和21d的团头肠组织制作石蜡组织切片，进行HE染色，然后拍照观察肠道形态和微绒毛结构变化。

分析发现，随着饥饿时间的增加，肠内褶皱减少，绒毛高度降低。

进一步增加显微镜倍数，观察微绒毛结构发现，随着饥饿时间的增加，柱状细胞排列紧密性下降，但杯状细胞的数量增加。

这说明，饥饿胁迫能够引起团头鲂肠道形态和微绒毛结构改变。

另外，团头鲂组织中AKP和ACP活性变化趋势相似，均呈“先降后升”的趋势，饥饿1d和4d时，AKP和ACP的活性下降，但与对照组之间并未有显著性差别。

随着饥饿时间的增加，它们的活性也逐渐增加，不同的是AKP在饥饿21d时活性最高，而ACP活性最高的时间点则是饥饿28d。

而SOD和CAT活性变化相对复杂，CAT总体上呈“降-升-降”的趋势，且各组的活性均低于对照组，除饥饿14d组外，其他组与对照组之间有显著性差异。

饥饿4d的SOD活力则显著高于包括对照组在内的所有组。

由此可见，短期饥饿胁迫会引起团头肠组织中AKP、ACP和CAT活力下降，但ACP和AKP的下降不具有显著性差别

长期饥饿胁迫则引起AKP和ACP活力显著增加，而SOD活力则显著降低。

我们利用斑马鱼和团头作为研究对象，研究饥饿胁迫对鱼类免疫机能的影响，探讨饥饿胁迫对肝脏和肠组织结构、TLR-MyD88-NFKB通路相关基因表达模式的影响。

主要研究结果为：遭受饥饿胁迫时，团头体重总体上显著下降，但在不同时间段下降速率不同。

斑马鱼和团头的肝脏和肠组织结构在遭受饥饿胁迫后产生变化，这些变化可能影响该组织甚至是整个机体免疫功能的发挥。

饥饿胁迫显著影响两种鱼肝脏和肠中TLR-MyD88-NFKB通路相关基因尤其是IL-IB和TNF-a等关键促炎细胞因子的表达，结果表明长期的食物剥夺会损害肠和肝脏组织的免疫功能。