有机污染物的富集量对毒性效应的影响：斑马鱼会受到影响吗？

09-19

每组分别收集6尾斑马鱼(雌雄比为1∶1)，取肝脏组织称量质量后，加入4mL乙腈和20ng对三联苯-d14内标物，机械匀浆后，冰浴超声萃取40min，离心收集上清液，残渣重复提取一次，合并提取液，旋转蒸发至2mL后，转移到预先活化的SPE(BondElut-PPL，200mg，3mL)固相小柱，4mL乙腈和2mL甲醇洗脱，洗脱物在温和氮气流中吹至近干，用500μL色谱纯正己烷重溶，转移至气质进样小瓶中，使用装载有HP-5MSUltraInert色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，安捷伦，美国)的气相色谱-三重四级杆质谱仪(GC-MS/MS，7890B-7000D，安捷伦，美国)测定TDCIPP的含量。

进样量为1μL，不分流模式，进样口温度290℃。

柱升温程序：50℃恒温2min，10℃∙min-1升温至220℃，保留0.5min，4℃∙min-1升温至240℃，保留1.5min。

传输线温度为300℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃。

TDCIPP和对三联苯-d14定性离子分别为75 m/z和224.2 m/z，定量离子分别为98.9、190.9、209和224.2 m/z。

样品分析时设置溶剂空白和肝脏空白样品作为对照监测实验过程的背景污染。

肝脏样品中对三联苯-d14的回收率为(94.4±10.6)%，TDCIPP的方法检出限为0.37μg·kg-1，数据处理中的TDCIPP最终浓度是样品浓度与空白样品TDCIPP最高检测值的差值。

斑马鱼肝脏新鲜组织(雌∶雄=1∶1)用PBS冲洗干净后，立即放入4%多聚甲醛中4℃固定过夜，经酒精梯度脱水(50%、70%、85%、95%和100%)和二甲苯透明后，石蜡包埋，制作超薄切片(4μm)，HE染色后，倒置荧光显微镜(LeicaDMi8，德国)观察肝脏组织病理学损伤程度，每个处理组设置3个平行。

每组称取3份约30mg湿质量的肝脏组织样品(雌∶雄=1∶1)，按质量体积比1∶9加入预冷PBS，冰浴机械匀浆5min后，1500r∙min-1离心10min收集上清液，按照试剂盒操作流程分别测定ROS、SOD、GPx、GSH、MDA和总蛋白的含量，评估肝脏氧化应激情况；另外，每组称取3份约20mg湿质量的肝脏组织样本，按照上述步骤制备组织匀浆上清液，与ELISA试剂盒样品混合反应后，采用酶标仪(SynergyH1，BioTek，美国)测定吸光度，采用ELISACalc软件对标准曲线进行Logistic拟合，计算样本中TNF-α和IL-6的绝对浓度，评估肝脏炎症水平，以上指标均用单位蛋白含量计算。

采用基于GC-MS/MS的非靶向代谢物组学分析方法鉴定污染胁迫下斑马鱼肝脏内源代谢物含量的变化。

每组收集斑马鱼肝脏新鲜组织50mg，液氮快速冷冻，加入2mL预冷的甲醇/氯仿/水混合提取液(体积比为2.5∶1∶1)研磨成匀浆，40℃微波萃取20min，离心收集上清液，残渣重复萃取一次，合并2次提取液到10mL离心管后加入500μL灭菌的高纯水，离心得到分层的样品溶液，取出下层的氯仿相氮吹至近干，与上层的甲醇/水相混合，氮吹后冷冻干燥，-80℃密封保存。

干燥的代谢物加入50μL吡啶溶解的O-甲基羟胺盐酸盐(20mg·mL-1)，涡旋振荡混匀后，30℃水浴90min，再加入80μL的MSTFA，37℃水浴30min。

经两步衍生化后的代谢物样品4℃高速离心8min(10000r∙min-1)，收集上清液转移至气质进样小瓶，GC-MS/MS上机检测，具体气相和质谱参数见我们前期研究报道。

数据采集以Scan模式获得总离子流色谱图，利用NIST14.0数据库对代谢物进行定性分析，生成包含化合物名称、保留时间、峰面积和匹配度等信息的文件。

根据保留时间和匹配度筛选代谢物，以峰面积表示代谢物相对含量。

使用SIMCA-P13.0软件包对数据进行多元统计分析，通过主成分分析(PCA)得出处理组与空白组之间代谢物的离散趋势，利用MetaboAnalyst5.0数据库对差异倍数>1.5的代谢物进行KEGG通路定位，找出显著富集的代谢通路。

所有实验组均设置3个生物学重复，实验结果用平均值±标准偏差表示。

使用SPSS20.0软件进行统计数据处理及单因素方差(ANOVA)分析，当P<0.05时，表示2组之间具有显著性差异，所有图均使用Origin9.0软件进行绘制。

SEM结果显示PAMPs为无规则的片状结构，粒径范围在1~20μm，其中粒径在5~15μm的塑料颗粒占比67.7%，平均粒径为(15.2±7.4)μm。

FTIR结果显示PAMPs具有显著的酰胺Ⅰ(—NH—C=O)、酰胺Ⅱ(—CH2—NH—)和氮氢(N—H)键)，这与PA(尼龙66)的红外标准谱峰一致，表明本实验使用的PAMPs不含有化学添加剂(与商家提供的信息一致)，因此毒性效应不涉及可能释放的添加剂的影响。

PAMPs的水体接触角为92.72°±3.2°，表明其具有一定的亲水性。

经4个月暴露处理后，PA(100μg·L-1)和低浓度TDCIPP(0.4μg·L-1和2μg·L-1)单独实验组中斑马鱼的体长和体质量与空白组之间均无显著性差异(P>0.05)，高浓度的TDCIPP(10μg·L-1)暴露导致斑马鱼体质量下降14.9%。

相比于空白组，100μg·L-1 PA和10μg·L-1 TDCIPP复合处理组斑马鱼的体长和体质量分别降低16.3%和24.8%(P<0.05)，表明PA和TDCIPP对斑马鱼生长表现出明显的协同抑制效应。

肝体指数分析表明，单一TDCIPP或PA暴露均对斑马鱼肝脏无显著影响，但中、高浓度联合暴露使斑马鱼肝体指数明显降低，相对于单独TDCIPP处理组分别降低9.5%和13.0%，表明环境相关浓度MPs的共存显著增强TDCIPP对斑马鱼肝脏的损伤效应，诱发明显的肝脏萎缩。

有机污染物的富集量是影响其毒性效应的关键因素，进一步分析斑马鱼肝脏TDCIPP含量发现，不同浓度的TDCIPP单一暴露时，斑马鱼肝脏内TDCIPP的富集量分别为0.18、0.54和4.12μg·g-1(以单位湿质量计)。

PAMPs存在条件下，复合处理组中斑马鱼肝脏内TDCIPP的富集含量分别达至0.32、0.83和5.30μg·g-1 ，这些数据显示PAMPs共存可显著促进TDCIPP在斑马鱼肝脏内的富集，这可能是斑马鱼生长抑制和肝脏损伤效应加重的原因之一。

通过肝脏ROS水平和抗氧化酶SOD、GPx活性及MDA含量分析，评估PA与TDCIPP单一及复合暴露对斑马鱼肝脏的氧化损伤效应。

相对于空白对照，单一TDCIPP处理组中斑马鱼肝脏ROS水平均有不同程度的升高，当浓度为10μg·g-1时，ROS水平提高了21.6%，同时单一PA暴露时ROS水平也显著升高(23.1%)。

PA和TDCIPP复合暴露组中肝脏ROS水平变化更为显著，相对于空白和单一TDCIPP处理组，分别上调26.8%~61.6%和19.6%~31.3%。

与此同时，SOD和GPx酶活性的变化呈现与ROS相似的趋势，从高到低的顺序为：PA+TDCIPP联合暴露组>PA暴露组>高浓度TDCIPP暴露组>>中、低浓度TDCIPP暴露组≈空白对照组。

相应地，中、高浓度联合暴露组中斑马鱼肝脏MDA含量相比于空白和TDCIPP暴露组分别提高18.9%~35.8%和12.5%~16.2%(P<0.05)。

上述研究结果表明，单一PA和TDCIPP暴露均一定程度上诱导斑马鱼肝脏组织ROS水平和抗氧化酶活性产生变化，二者联合暴露时肝脏ROS水平上调更为明显，抗氧化酶系统干扰程度加重，表现出更为显著的氧化损伤。

进一步通过分析TNF-α和IL-6炎症因子水平变化，评估污染胁迫下斑马鱼肝脏的炎症响应。

环境浓度TDCIPP暴露不会诱发斑马鱼肝脏出现明显的炎症反应，单一PA暴露时，IL-6含量相对于空白增加28.3%；PA和TDCIPP联合暴露诱导最为显著的炎症反应，当PA和TDCIPP浓度分别为100μg·L-1和10μg·L-1时，相对于空白组和单一TDCIPP暴露组，TNF-α含量分别提高50.3%和35.8%，IL-6含量分别提高94.3%和63.5%(P<0.05)，表明复合暴露中PA显著增强TDCIPP诱发的斑马鱼肝脏炎症效应。